Neuroblastoma: częsty nowotwór wieku dziecięcego

Iwona Schymalla

Opublikowano 11 lipca 2022, 09:15

Iwona Schymalla

Opublikowano 11 lipca 2022, 09:15

Dość rzadko porusza się temat neuroblastoma, często rozpoznawanego nowotworu złośliwego u dzieci. Czy to jest choroba, która dotyka tylko dzieci? Ilu mamy pacjentów w Polsce?

Neuroblastoma, czyli nerwiak zarodkowy współczulny (taka jest nazwa polska), jest jednym z najczęstszych nowotworów wieku dziecięcego. Wśród wszystkich nowotworów stanowi około 8 procent. Najczęściej chorują na niego dzieci do piątego roku życia. Dzieci powyżej 10 roku życia na neuroblastoma chorują rzadko (ok. 3-5 proc.). Wyjątkowo rzadko nowotwór ten rozpoznaje się u osób dorosłych. W Polsce, każdego roku rozpoznajemy ok. 70 nowych zachorowań w różnym stopniu zaawansowania. Niestety, w momencie postawienia rozpoznania ok. 50 procent dzieci ma już czwarty stopień zaawansowania, co bardzo pogarsza rokowanie, a także wymaga obciążającego intensywnego leczenia.

Wspomniała Pani Profesor o kilku stopniach zaawansowania tej choroby. Jak wygląda leczenie w pierwszym stadium i bardziej zaawansowanej chorobie?

Dodam jeszcze, że neuroblastoma jest szczególnym nowotworem wieku dziecięcego. Charakteryzuje się licznymi objawami wynikającymi z różnych pierwotnych lokalizacji choroby, obecnych przerzutów i zaburzeń metabolicznych, a także zróżnicowanym przebiegiem choroby. U niemowląt spotykamy się z samowyleczeniem (samoistną remisją, czyli ustąpieniem guza). W przypadku części dzieci choroba przebiega bardzo złośliwie, wręcz w sposób galopujący i nieprzewidywalny. U najstarszych dzieci obserwuje się progresję choroby o powolnym przebiegu. I tak jak zróżnicowany jest obraz kliniczny tej choroby, tak zróżnicowane jest jej leczenie. Aktualny sposób leczenia dzieci z neuroblastoma został opracowany na podstawie wieloośrodkowych międzynarodowych wyników badań i zależy nie tylko od wieku dziecka i stopnia zaawansowania, ale także od nieprawidłowości chromosomalnych i genowych obecnych w komórkach nowotworowych. Zależy także od budowy histopatologicznej guza i rodzaju odpowiedzi na wstępnie zastosowane leczenie. Dzieci do 3 miesiąca życia z jednostronnym małym guzem nadnercza oraz z neuroblastoma w 4s stopniu zaawansowania bez objawów choroby i bez obecnej amplifikacji genu N-MYC (marker złej prognozy) poddaje się obserwacji i okresowym badaniom kontrolnym, a leczenie wdraża się z chwilą rozpoznania progresji choroby. W przypadku stwierdzenia pojedynczego operacyjnego guza u dzieci powyżej 3 miesiąca życia wystarcza zabieg operacyjny, gdy w komórkach usuniętego guza nie ma amplifikacji genu N-MYC. Przy takim postępowaniu w 90% przypadków nie stwierdza się nawrotów choroby, a w przypadku wznowy po odpowiedniej terapii rokowanie jest dobre.

Kolejną grupę stanowią pacjenci wymagający zastosowania chemioterapii o niskim lub pośrednim stopniu intensywności. Są to dzieci z neuroblastoma w 2 i 3 stopniu zaawansowania z guzem nieoperacyjnym, niemowlęta w 4 stopniu zaawansowania oraz z objawową postacią stopnia 4s - bez amplifikacji genu N-MYC.

A czym jest neuroblastoma wysokiego ryzyka? Jak aktualnie leczy się ten typ neuroblastoma?

Do grupy neuroblastoma wysokiego ryzyka kwalifikuje się wszystkie dzieci powyżej 1. r. ż. w 4 stopniu zaawansowania choroby, wszystkich pacjentów w 2 i 3 stopniu zaawansowania, a także niemowlęta w 4 i 4s stopniu zaawansowania z obecną amplifikacją genu N-MYC. W grupie wysokiego ryzyka stosuje się bardzo intensywne wieloetapowe skojarzone leczenie. Każdy etap ma istotne znaczenie. Jeśli uzyskana zostanie dobra odpowiedź, oceniana po zastosowaniu wstępnej chemioterapii zwanej indukcyjną, to pacjentowi pobiera się macierzyste komórki krwiotwórcze i rozważa się usunięcie pozostałości guza pierwotnego. W kolejnym etapie podaje się chemioterapię wysokodawkowaną, po niej przeszczepienie własnych komórek krwiotwórczych, a następnie radioterapię na obszar po usuniętym guzie. Ostatni etap dotyczy terapii minimalnej choroby resztkowej. Stosuje się pochodną witaminy A (kwas 13-cis-retinowy) oraz immunoterapię z użyciem przeciwciała przeciwko antygenowi (gangliozyd GD2) obecnemu powierzchni komórki neuroblastoma. Kwas 13-cis retinowy ma doprowadzić złośliwe komórki neuroblastoma, pozostałe gdzieś w zakątkach organizmu do postaci mniej złośliwych, a także sprzyja zniszczeniu tych pozostałych komórek nowotworowych. Dostarczone przeciwciała anty-GD2 łączą się z komórkami neuroblastoma, tworząc kompleksy rozpoznawane przez własny układ immunologiczny jako obce, co mobilizuje komórki immunologicznie kompetentne do niszczenia komórek GD2-pozytywnych. Tak pokrótce przedstawia się program leczenia neuroblastoma.

Obecnie około 70 procent wszystkich dzieci z tym nowotworem może uzyskać wyleczenie. Wyleczalność niemowląt w 1., 2. i 3. stopniu zaawansowania oraz stopniu 4s bez amplifikacji genu N-MYC jest wyższa niż 90 procent a u dzieci starszych w NBL zlokalizowanym bez amplifikacji genu N-MYC wynosi 70-90 procent. U części niemowląt obserwuje się samoistną regresję choroby. Pomimo stosowania coraz intensywniejszych programów chemioterapii, łącznie z radykalnymi operacjami i przeszczepieniami komórek krwiotwórczych, rokowanie w grupie wysokiego ryzyka stanowiącej ponad 30 procent wszystkich dzieci z neuroblastoma, jest nadal niepomyślne. Przed 2001 r. w neuroblastoma wysokiego ryzyka w Polsce uzyskiwano tylko około 10% wyleczeń. Po wprowadzeniu ujednoliconego wieloetapowego skojarzonego protokołu leczenia bez immunoterapii, odsetek ten wzrósł do 30-40%, a po zastosowaniu dodatkowo przeciwciał anty-GD2 wyleczalność w tej postaci neuroblastoma zwiększyła się do ponad 60 procent.

Czy można powiedzieć, że to leczenie i dostępność do niego w Polsce, jest zgodne ze światowymi standardami? Jakie jest doświadczenie krakowskiego ośrodka, jeśli chodzi o dzieci, u których jest neuroblastoma wysokiego ryzyka?

Od wielu lat, a dokładnie od 2001 roku, leczenie neuroblastoma w naszym kraju oparte jest na doświadczeniach europejskiej grupy ds. neuroblastoma (grupa SIOPEN). Od tego właśnie roku nasz kraj jest członkiem Grupy SIOPEN. Onkologia dziecięca jest dziedziną chorób rzadkich, a neuroblastoma wysokiego ryzyka kwalifikuje się co chorób ultrarzadkich. Dlatego uzyskanie wiarygodnych wyników badań oraz postęp terapeutyczny w leczeniu chorób nowotworowych u dzieci jest możliwy jedynie w ramach współpracy międzynarodowej.

W naszym kraju koordynację dotyczącą diagnostyki i leczenia poszczególnych nowotworów powierzono kilku wiodącym ośrodkom onkologii i hematologii dziecięcej. Ośrodek koordynujący jest odpowiedzialny za sukcesywne wprowadzanie nowych, lepszych programów leczenia przeciwnowotworowego oraz doskonalenie terapii wspomagającej, a także analizowanie wyników leczenia i występujących powikłań. Jednostka koordynująca powinna także zapewnić dostęp do nowoczesnych badań diagnostycznych umożliwiających prawidłowe zakwalifikowanie pacjenta do grupy ryzyka i do optymalnej terapii. Pomaga rozwiązywać problemy diagnostyczne i terapeutyczne. Klinice Onkologii i Hematologii Dziecięcej w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Krakowie została powierzona m.in. koordynacja diagnozowania i leczenia nerwiaka zarodkowego współczulnego, czyli neuroblastoma (od 2001). Stąd byliśmy zobowiązani do poszukiwania najlepszych sposobów diagnozowania i leczenia tego nowotworu. Sukcesywnie wdrażaliśmy nowe lub modyfikowaliśmy stosowane już ujednolicone protokoły terapeutyczne. Równocześnie z optymalizacją leczenia przeciwnowotworowego i terapii wspomagającej, doskonalona była wielodyscyplinarna diagnostyka. Obecnie w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Krakowie mogą być wykonywane badania genetyczne u wszystkich dzieci z neuroblastoma w Polsce (Zakład Genetyki Medycznej w USD w Krakowie).

Rozpoczęcie immunoterapii przeciwciałami anty-GD2 w naszym kraju nie było łatwe. Jako koordynator krajowy ds. neuroblastoma, od momentu dostępności przeciwciał anty-GD2 w Europie (2006 r.), starałam się wprowadzić w USD w Krakowie innowacyjną i unikalną w skali kraju terapię z ich wykorzystaniem u dzieci z neuroblastoma wysokiego ryzyka. Początkowo (do 2018 r.) pozyskanie przeciwciał anty-GD2 było możliwe tylko w ramach niekomercyjnego badania klinicznego. W związku z prawno-formalnymi trudnościami, program HR-NBL-1/SIOPEN jako niekomercyjne badanie kliniczne udało się zarejestrować dopiero w 2014 r. W międzyczasie w literaturze pojawiało się coraz więcej dowodów na skuteczność immunoterapii w leczeniu neuroblastoma wysokiego ryzyka. Wobec tego, że w Polsce niemożliwe było wtedy stosowanie tej terapii, ośrodek krakowski szukał możliwości przeprowadzenia tego leczenia za granicą. Do 2015 r. u ok. 30 dzieci przeprowadzono immunoterapię w ośrodkach zagranicznych. W związku z zapowiadaną deklaracją pomocy ze strony Ministerstwa Zdrowia, Uniwersytet Jagielloński – Collegium Medicum zgodził się być krajowym sponsorem (instytucja odpowiedzialna za prawidłową realizację) badania HR-NBL-1/SIOPEN (rejestracja 2014). Pierwszą immunoterapię w Klinice Onkologii i Hematologii Dziecięcej w Krakowie przeprowadzono w lutym 2015 r. Dzięki immunoterapii przeciwciałami anty-GD2 wprowadzonej w naszej Klinice, dzieci z neuroblastoma wysokiego ryzyka od 2015 r. nie musiały wyjeżdżać do zagranicznych ośrodków. Podanie niezarejestrowanego preparatu do grudnia 2015 r. łączyło się z dużymi kosztami, które były pokrywane ze środków charytatywnych. Dzięki inicjatywie Uniwersytetu Jagiellońskiego – Collegium Medicum i Kliniki Onkologii i Hematologii Dziecięcej w Krakowie, w listopadzie 2015 r. została wprowadzona korzystna nowelizacja ustawy dla niekomercyjnych badań klinicznych. Dzięki wprowadzonej poprawce dotyczącej ustawy Prawo Farmaceutyczne, powstała możliwość finansowania przez NFZ standardowej diagnostyki i leczenia realizowanych w ramach niekomercyjnego badania klinicznego. Dotąd w naszym kraju immunoterapię przeciwciałami anty-GD2 przeprowadzono u ponad 100 pacjentów z neuroblastoma.

Po zarejestrowaniu przeciwciał anty-GD2 w Europie (dinutuksymab beta) początkowo ich zakup był finansowany ze środków charytatywnych. Uzyskana dzięki immunoterapii poprawa wyników terapii neuroblastoma z grupy wysokiego ryzyka, spowodowała, że MZ w Polsce wyraziło zgodę na finasowanie tego leku, najpierw w ramach programu ratunkowego dostępu do terapii lekowej (2018 r.), a następnie także (od września 2020 r.) w ramach programu lekowego. Dzięki temu obecnie każde dziecko w Polsce z neuroblastoma, u którego istnieją wskazania do zastosowania przeciwciał anty-GD2, ma bezpłatny dostęp do tej metody leczenia. Immunoterapia przeciwciałami anty-GD2 musi być przeprowadzana w warunkach oddziału wysokiego nadzoru, wymaga zastosowania odpowiedniej terapii wspomagającej i wnikliwego monitorowania pacjenta. W celu umożliwienia immunoterapii jak najbliżej miejsca zamieszkania dziecka, Klinika Onkologii i Hematologii Dziecięcej w Krakowie prowadziła i nadal prowadzi szkolenia dla lekarzy, pielęgniarek i farmaceutów z innych ośrodków onkologii i hematologii dziecięcej w Polsce. Ponadto co rok organizuje ogólnopolskie konferencje naukowo-szkoleniowe dla specjalistów leczących neuroblastoma u dzieci oraz zbiera dane z całej Polski.

Obecnie, oprócz ośrodka krakowskiego, terapia z użyciem dinutuksymabu beta, jest przeprowadzana we Wrocławiu (od 2019 r.) i w Warszawie, w IP-CZD (od 2021 r.).

Dzięki zastosowaniu ukierunkowanej immunoterapii przeciwciałami anty-GD2, czyli skierowanej na antygen, który mieści się na komórkach neuroblastoma (gangliozyd GD2), wyniki leczenia w grupie wysokiego ryzyka neuroblastoma poprawiły się o 20%.

Oczywiście, uzyskana poprawa wyników leczenia stanowi sukces, ale to jeszcze za mało, bo około 30-40 proc. dzieci z grupy wysokiego ryzyka ciągle nie udaje nam się wyleczyć. Dlatego zobligowani jesteśmy do ciągłego wprowadzania nowych sposobów leczenia, wzorując się na doświadczeniach innych krajów oraz własnych doświadczeniach.

To rzeczywiście zaskakujące wyniki badania. Pani Profesor powiedziała o niekomercyjnym badaniu klinicznym, które rozpoczęło się w ubiegłym roku.

Pomimo stosowania coraz intensywniejszych standardowych wielolekowych chemioterapii, łącznie z operacjami chirurgicznymi, megachemioterapią i autologicznymi przeszczepieniami komórek krwiotwórczych oraz celowaną immunoterapią, rokowanie w grupie wysokiego ryzyka, jest nadal niepomyślne. Długie przeżycia uzyskuje tylko 60% pacjentów. Około 15% pacjentów źle odpowiada na początkową chemioterapię, ma już wstępnie oporną chorobę i nie kwalifikuje się do dalszych etapów leczenia, w tym wysokodawkowanej chemioterapii i auto-przeszczepienia komórek krwiotwórczych oraz immunoterapii. Ponadto w trakcie immunoterapii lub po jej zakończeniu u około 25% dzieci występują wznowy choroby. Aktualnie nie ma skutecznego standardowego leczenia dla pacjentów ze wznową lub neuroblastoma pierwotnie opornym na leczenie, a stosowane dotychczas metody leczenia nie tylko nie dają szansy na uzyskanie trwałej remisji choroby, ale nasilają toksyczności.

W grudniu 2021 r. w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Krakowie rozpoczęto realizację niekomercyjnego badania klinicznego finansowanego przez Agencję Badań Medycznych w temacie „Immunoterapia z zastosowaniem dinutuksymabu beta skojarzona z chemioterapią w leczeniu pacjentów z neuroblastoma pierwotnie opornym na leczenie standardowe oraz ze wznową lub progresją choroby.” Ideą nowego programu jest wykorzystanie synergicznego działania chemioterapii i immunoterapii z użyciem przeciwciał anty-GD2, leku dinutuksymabu beta. Takie postępowanie stanowi szansę na przełamanie oporności komórek neuroblastoma i uzyskanie zadowalającej regresji zmian chorobowych, a nawet remisji, co umożliwi przeprowadzenie dalszych etapów terapii i zwiększenie szansy na trwałe wyleczenie. Aktywność tego rodzaju leczenia została udowodniona w badaniach klinicznych I i II fazy prowadzonych przez onkologów dziecięcych w USA, jednak dane dotyczące jego bezpieczeństwa i skuteczności nie są jeszcze całkowicie poznane. Wstępne wyniki własnego badania pilotażowego wskazywały na możliwość dalszej poprawy wyników leczenia u dzieci z neuroblastoma. Jest to leczenie poza wskazaniami rejestracyjnymi leku. Nie ma tu udziału firmy farmaceutycznej. Celem tego badania nie jest rejestracja nowego produktu lub wskazania, ale głównym celem obecnego badania jest ocena bezpieczeństwa podawania przeciwciał anty-GD2 w połączeniu z konwencjonalną chemioterapią oraz wstępna ocena skuteczności terapii. Planuje się zrekrutowanie 20 pacjentów, którzy otrzymają 5-7 cykli, w których przeciwciała anty-GD2 będą stosowane w skojarzeniu z chemioterapią. Wszystkie dzieci w Polsce, u których rozpoznaje się pierwotną lub wtórną oporność na leczenie mogą być leczone w Krakowie i uzyskać szansę na wyleczenie lub znaczące przedłużenie życia. Ponadto, dzięki uzyskanemu finansowaniu, wprowadzona zostanie rozszerzona ocena aktywności układu immunologicznego oraz eliminacji komórek neuroblastoma ze szpiku kostnego, a także ocena panelu genów biorących udział w kontroli układu immunologicznego oraz mogących mieć związek z odpowiedzią układu immunologicznego na stosowany u pacjenta z NBL rodzaj leczenia. W badaniach genetycznych zostaną zastosowane innowacyjne techniki, takie jak: metoda sekwencjonowania następną generacją (next generation sequencing, NGS) oraz metoda sekwencjonowania na poziomie pojedynczej komórki (single-cell RNA sequencinq, scRNA-seq). Do końca czerwca 2022 do badania zostało zrekrutowanych 5 pacjentów. Nasze wstępne wyniki wskazują na możliwość dalszej poprawy wyników leczenia w neuroblastoma bardzo wysokiego ryzyka, czyli w tej grupie pacjentów, dla której dotychczasowe metody były niewystarczające.

Czy istniejący program lekowy spełnia oczekiwania pacjentów i lekarzy?

W grudniu 2020 roku udostępniony został program lekowy „Leczenie dinutuksymabem beta pacjentów z nerwiakiem zarodkowym współczulnym”, dzięki któremu uzyskano zabezpieczenie finansowe na zakup przeciwciał anty-GD2 (lek dinutuksymab beta) dla dzieci, które kwalifikują się do tego programu. Do końca maja 2022 r. do programu lekowego zostało włączonych 30 dzieci. Spośród nich 22 dzieci zakończyło leczenie, w tym 18 otrzymało wszystkich pięć cykli immunoterapii. Remisja choroby u trzymuje się u 82% leczonych dzieci, a u czworga pacjentów wystąpił nawrót choroby. W trakcie leczenia pozostaje 7 dzieci.

Do programu lekowego mogą być włączeni pacjenci, u których planuje się leczenie dinutuksymabem beta zgodnie z charakterystyką produktu leczniczego (ChPL) i obejmuje dzieci z grupy wysokiego ryzyka dobrze odpowiadających na wstępne leczenie lub ze wznową choroby nie wymagającą połączenia immunoterapii przeciwciałami anty-GD2 z chemioterapią lub z innym rodzajem immunoterapii. Pacjenci, którzy mają wskazania do terapii z udziałem dinutuksymabu beta poza wskazaniami rejestracyjnymi, zakup leku mogą mieć sfinansowany w ramach programu ratunkowego dostępu do terapii lekowej (RDTL). Przeciwciała anty-GD2 są lekiem stosunkowo drogim, ale dzięki programowi lekowemu i programowi RDTL wszystkie dzieci w Polsce, jeżeli tylko potrzebują tego sposobu leczenia, mają do niego dostęp. Mamy nadzieję na kontynuację obu programów.

Jak już wspomniałam wcześniej, leczenie neuroblastoma wysokiego ryzyka obejmuje kilka etapów. Pełna i terminowa realizacja każdego z tych etapów ma istotne znaczenie dla uzyskania wyleczenia. Program lekowy gwarantuje realizację tylko ostatniego etapu leczenia, terapię minimalnej choroby resztkowej. Obecnie do tego etapu ma szansę dotrzeć tylko około 80% PACJENTÓW z grupy wysokiego ryzyka.

Dlatego obecnie największym wyzwaniem dla nas jest rejestracja w naszym kraju nowego programu dla neuroblastoma wysokiego ryzyka (HR-NBL-2/SIOPEN). Wprowadzone zmiany, szczególnie w początkowych etapach leczenia, pozwolą po przeprowadzeniu chemioterapii indukcyjnej na wyodrębnienie grupy wysokiego ryzyka i zastosowanie odrębnego sposobu leczenia, zwiększającego szansę na uzyskanie całkowitej remisji i przeprowadzenia kolejnych etapów terapii zwiększających szansę całkowitego wyleczenia. Wprowadzone zostały również zmiany w leczeniu grupy pacjentów, którzy dobrze odpowiedzieli na chemioterapię indukcyjną i ma to na celu zmniejszenie ryzyka wystąpienia wznowy choroby. Nowy program może być realizowany tylko w formie niekomercyjnego badania klinicznego. Sponsor badania HR-NBL-2/SIOPEN, Institut Gustave Roussy w Paryżu, wskazuje siebie jako właściciela wyników uzyskanych w tym międzynarodowym badaniu, co nie pozwala na uzyskanie przez nas finansowania ze strony Agencję Badań Medycznych. Agencja popiera realizację i finansuje krajowe projekty. Zapisy prawne Agencji ograniczają możliwości uzyskania dofinansowania dla międzynarodowych projektów realizowanych w formie niekomercyjnych badań klinicznych w przypadku, gdy właścicielem wyników badań jest zagraniczny sponsor lub ma do nich dostęp bez wcześniejszych uzgodnień z Agencją. Tymczasem w onkologii dziecięcej konieczna jest międzynarodowa współpraca wieloośrodkowa. Nowy program terapeutyczny dla nowotworów u dzieci tworzy się na podstawie twardych dowodów uzyskanych poprzez analizy odpowiednio licznej grupy pacjentów. Brak finansowania opóźnia rejestrację badania HR-NBL-2/SIOPEN i możliwość szybkiej realizacji tego badania u dzieci w Polsce.

Kolejny istotny problem stanowi ograniczony dostęp dzieci z neuroblastoma w Polsce do scyntygrafii z zastosowaniem metajodobenzyloguanidyny (MIBG) znakowanej jodem radioaktywnym. W neuroblastoma scyntygrafia z użyciem radioznacznika wychwytywanego przez komórki nowotworowe umożliwia zlokalizowanie przerzutów przed rozpoczęciem leczenia, a w trakcie terapii pozwala ocenić uzyskaną odpowiedź na zastosowaną chemioterapię. Dla postępu w onkologii ważny jest również rozwój i dostępność odpowiednich badań obrazowych. Istnieje pilna potrzeba poprawy dostępności badania scyntygraficznego z udziałem specyficznego radioznacznika dla dzieci z neuroblastoma.

Ważne jest również, aby u wszystkich dzieci z tym nowotworem były wykonywane badania cytogenetyczne i molekularne tkanki guza celem określenia rodzaju nieprawidłowości chromosomalnych i genowych, co jest niezbędne dla wyboru najbardziej odpowiedniego leczenia dającego największą szansę wyleczenia. Już w tej chwili u pacjentów z nieprawidłowościami w zakresie genu ALK (dotyczy 10-15% pacjentów z NBL), oprócz standardowego leczenia, można zastosować inhibitor kinazy ALK trzeciej generacji (lorlatinib) istotnie zwiększający szansę na wyleczenie.

Istotne jest również wcześniejsze rozpoznawanie nowotworu, co może się przyczynić do zmniejszenia występowania źle rokującej, zaawansowanej choroby i również wpłynie na poprawę wyników leczenia.

W związku z tym, że neuroblastoma wysokiego ryzyka należy do chorób ultrarzadkich, ważne jest utrzymanie międzynarodowej wieloośrodkowej współpracy.

Pobierz ten artykuł w formacie .pdf

Tematy

neuroblastoma / Walentyna Balwierz / choroby rzadkie / nowotwór / dzieci
PN WT ŚR CZ PT SO ND
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31